Участници: Милена Мурджева

Наименование на посетената институция: Placenta Labor, изследователска група към департамент по генекология, Friedrich Schiller Universitat, Йена, Германия (http://www2.uni-jena.de/ufk/placentalabor/cms/).

Ръководител на Placenta Labor е Prof. Dr. Udo Markert, партньор по ReProForce проекта.

Изследвателският екип на Клиниката по акушерство и гинекология работи по редица теми, свързани с бременността, включително имунологични механизми на имплантиране на ембриона, регулация на трофобластната инвазия, регулация на децидуални имунни клетки, както и алергологични, фармакологични проблеми и аспекти на храненето. Лабораторията е член на Европейската мрежа EMBIC ("The control of Embryo Implantation").

Период на посещение: 16 януари – 15 февруари 2012г.

Цел на посещението:

Темата на едномесечния проект бе „Изследване на експресията на Прогестерон индуциран блокиращ фактор (Progesterone Induced Blocking Factor - PIBF) в децидуални мезенхимни стволови клетки (DSC)”.

Изследователската програма включваше:

- Доказване на експресията на PIBF в мезенхимни стволови клетки (MSC), изолирани от костен мозък (BM-MSC), мастна тъкан (ASC) и ранна децидуа (DSC);

- PCR за доказване на mRNA- PIBF експресия в мезенхимни стволови клетки (MSC), изолирани от костен мозък (BM-MSC), мастна тъкан (ASC) и ранна децидуа (DSC);

- siRNA подтискане на PIBF в първични клетъчни култури от MSC;

- Изолиране на мезенхимни стволови клетки от плацента (pMSC).

Посещението започна с въвеждане в лабораторните практики и правила и съставяне на подробен план на изследванията, които ще се проведат по време на посещението. В първите дни Милена беше запозната с някои основни методи, прилагани в лабораторията, които не са част от нейния изследователски план, но представляват интерес за работата в ИБИР като миграционен тест, инвазионен тест и други. ReProForce проекта и изследванията на ИБИР бяха представени от Милена Мурджева на редовен лабораторен семинар в последния ден от посещението й. Милена Мурджева представи и резултатите, получени по време на едномесечния престой в партньорската лаборатория. Бяха обсъдени бъдещите възможности за изследвания по проблема за експресията и ролята на PIBF по време на бременността. На госта беше предоставена възможността да участва в работата на лабораторния семинар, който се провежда всеки вторник, както и в литературния семинар, провеждан всеки четвъртък. На един от тези семинари беше представена новата технология Zinc Finger Nuclease от представители на фирма Sigma. Тази технология е последната дума на методите за насочена корекция на генома, причиняваща двойноверижни ДНК скъсвания в специфични последователности, избрани от изследователя.

• Доказване на експресията на PIBF в мезенхимни стволови клетки (MSC), изолирани от костен мозък (BM-MSC), мастна тъкан (ASC) и ранна децидуа (DSC);

Протеини, получени от фракцията Trizol, след изолиране на РНК и ДНК, бяха измерени по метода на Bradford. Количествата белтък във всяка от пробите беше изравнено и беше проведена електрофореза, трансфер и блот съгласно протоколите на лабораторията. Протоколите и буферите използвани в Placenta Lab ще бъдат използвани за надграждане на методите, прилагани в лабораториите на ИБИР.

Резултати: И трите типа мезенхимни стволови клетки показаха значителни нива на експресия на PIBF протеина. Необходимо е резултатите, получени чрез използването на поликлонални заешки IgG, да бъдат допълнени от изследвания с моноклонално антитяло 3A6 анти-rhPIBF, като това ще потвърди и уточни експресираните от мезенхимните стволови клетки сплайсинг варианти на PIBF.

• PCR за доказване на mRNA-PIBF експресия в мезенхимни стволови клетки (MSC), изолирани от костен мозък (BM-MSC), мастна тъкан (ASC) и ранна децидуа (DSC);

За изпълнението на PCR бяха използвани cDNA, изолирани от BM-MSC, ASC и DSC. Резултатите бяха анализирани чрез агарозна електрофореза. Всички експерименти бяха проведени по протоколите на Placenta lab. Изолирана беше тоталната RNA от Trizol третираните проби, последвана от cDNA синтеза чрез GoScript™ Reverse Transcription System kit. Получената cDNA беше използвана за изследване на експресията на mRNA-PIBF чрез три различни двойки праймери. Агарозна електрофореза UV – имиджинг бяха приложени за доказване на PCR продуктите. Бяха коментирани принципите на програмите за конструиране на праймери, за проверка за праймер-димери, за специфичност на праймерите.

Резултати: Само една от трите двойки праймери доведе до получаване на специфичен PCR продукт. Бяха оптимизирани условията на PCR реакцията. Работата по изследване на PIBF mRNA експресията при МSC ще продължи в ИБИР.

• siRNA подтискане на PIBF в първични клетъчни култури от MSC;

Протоколите, прилагани в Placenta lab за трансфекции на клетки със PIBF siRNA бяха приложени на първични култури от мезенхимни стволови клетки с цел подтискане на експресията на PIBF протеина. PIBF siRNA #1 и #3 и TurboFect реагент (Fermentas) бяха използвани за подтискането. Изследвани бяха две времеви продължителности 24 часа и 72 часа. След третирането клетките бяха лизирани чрез Lysis Buffer (Cell Signaling), беше измерено количеството на протеините чрез Bradford (BioRad), равни количества от siRNA третираните и контролните клетки бяха нанесени на електрофорезен гел. За имуноблота беше използван анти-49kDa rhuPIBF заешки IgG (RabbitN1, II bleeding; protein G purified rabbit IgG). Блотовете бяха проявени чрез Luminate Forte (Millipore), след което мембраната беше изчистена чрез mild stripping buffer (Abcam) и инкубирана с анти-bActin антитяло като вътрешна контрола за блота. След проявяването, получените ивици за PIBF и bActin бяха анализирани.

Резултати: Не беше отчетена разлика в PIBF експресията между третираните и контролните клетки. Използваните siRNA и/или условия на провеждане на експериментите не са подходящи за подтискане на PIBF експресията при MSC.

• Изолиране на мезенхимни стволови клетки от плацента (pMSC)

По молба на домакините Милена Мурджева приложи използваните в ИБИР протоколи за получаване на мезенхимни стволови клетки за получаване на MSC от плацента. Тъканта на плацентата беше нарязана на малки парченца и третирана с колагеназа. Получената клетъчна суспензия беше центрофугирана и клетъчната утайка беше ресуспендирана в среда DMEM (PAA) и посята. Средата беше сменена след 24 часа и след това през ден.

Резултати: Протоколът се нуждае от допълнително оптимизиране, за да бъде прилаган успешно за изолиране на мезенхимни стволови клетки от плацента. Получените клетки имат някои черти на мезенхимни стволови клетки. В деня след изолирането бяха забелязани единични фибробластоподобни клетки, които бързо пролиферираха и оформиха плътен монослой (до 10 ден след изолирането).