Участници: главен асистент Кирил Шумков    

Наименование на посетената институция:

Партньорски център в Австрия - University of Veterinary Medicine Vienna, Institute for Animal Breeding and Genetics, Department for Agrobiotechnology, IFA-Tulln, AG Biotechnology.

Период на посещение: 06.06.2011 – 30.06.2011

Цел на посещението: Обмяна на опит по тема:"Ин витро продуциране на говежди ембриони".

Осъществена бе научна програма, включваща:

1. Пунктиране на яйчници от заклани говеда.

Яйчниците на говедата се събират до 30-та минута от заколването и се поставят в транспортния медиум, който е със стайна температура и се доставят в рамките на 4 часа в лабораторията.

В лабораторията яйчниците се измиват двукратно с PBS и всички фоликули с големина 2-8 мм се пунктират. За целта се използва игла 18 G и еднократна спринцовка от 5 мл (може да се използва и вакуум помпа при 60 mmHg отрицателно налягане). Така получената фоликулна течност се събира в 50 милилитрови фалконови епруветки, които са на водна баня на 38,0 ^оС. След 15-30 минутен престой, посредством стерилна пастьорова пипета се събира седимента и се прехвърля в квадратно петри с разграфено дъно. Към седимента се добавя същото количество от фоликулната течност (за по-добра видимост) и се поставя на стереомикроскоп за събиране на кумулус-ооцитните комплекси (КОК). Комплексите се класифицират и само тези от клас 1 и 2 (по Leibfried and First, 1979) се избират за IVP (In vitro production).

2. Ин витро продукция на говежди ембриони

• Ин витро матурация (IVM)

 Получените от пунктата говежди КОК се промиват двукратно в по 2 мл. промивен медиум и един път в 2 мл матурационен медиум преди да се прехвърлят в 4 ямково петри. За промивен медиум се използва модифициран медиум на Паркър с прибавен към него естрален кравешки серум, а за матурационен медиум се използва промивен медиум, но с прибавен към него и фоликуло-стимулиращ хормон. Във всяка ямка от това петри, предварително напълнена с по 400 µl от матурационния медиум и парафиново масло, се поставят около 30 кумулус-ооцитни комплекса (КОК) и се инкубират на 39 ^оС, 5%СО₂, при максимална влажност.

•  Ин витро фертилизация (IVF) 

При подготовка на сперматозоидите се използва метода „swim-up” (Parrish et al., 1986) при дълбоко замразена в пайети сперма от бик. Пайетите се размразяват за 10 сек. във водна баня на 38^оС, подсушават се и съдържанието им се изсипва в 10 мл. фалконова епруветка. Подготвят се 15-милилитрови фалконови епруветки, като в тях се поставят по 1,6 мл. от капацитационния медиум, след което внимателно във всяка се подслояват по 200 µl от размразената сперма. Капацитационният медиум се състои от Na- Pyruvate, Bovine Serum Albumin, Gentamycin- стоков р-р, Sperm-Tyrode’s Lactate стоков р-р. За да се разделят подвижните от неподвижните сперматозоиди, епруветките се инкубират за 45 мин. на 39 ^оС. Прозрачната надлежаща течност (около 1400 µl) след това се отпипетира, поставя се в нова 15 милилитрова фалконова епруветка и се центрофугира за 15 мин. на 200g. След това супернатантата се редуцира до обем, приблизително равен на 3-кратния обем на пелета. Следва ресуспендиране на пелета. Концентрацията на сперматозоидите се определя с помощта на Neubauer- броителна камера и се определя необходимият обем от сперматозоидната суспензия, който да се добави към ооцитите, така че крайната концентрация да е 1 млн. сперматозоида на милилитър.

Матурираните ооцити, които се отличават със значително експандиран кумулус, се преместват в предварително подготвените кладенчета на 4-ямково петри, които са запълнени с по 400 µl фертилизационен медиум + 20 µl Heparin- медиум и покрити със същия обем минерално масло. фертилизационният медиум се състои от BSA, Pyruvate и Tyrode’s Lactate стоков р-р. 30 минути след това се добавя и пресметнатият обем от сперматозоидната суспензия. Ооцитите и сперматозоидите се инкубират за 20-22 часа при 39 ^оС, 5% СО₂ и максимална влажност (100%).

• Ин витро култивиране (IVC)

За ин витро култивирането, се подготвят 4-ямкови петрита, всяко кладенче от които се запълва с по 400 µl култивационен медиум и покрити със същия обем минерално масло. Кумулус-ооцитните комплекси, респ. Ембрионите се прехвърлят във фалконова епруветка с 1 мл. m-PBS и се поставят за 90 сек. на Vortex, за да се отделят кумулусните клетки от zona pellucida. След това съдържанието на епруветката се прехвърля в малка петриева паничка, епруветката се облива допълнително с m-PBS и петрито се поставя под стереомикроскоп (увеличение 40х), за да се съберат зиготите. Следващата стъпка е промиването им в 2 мл. култивационен медиум. Култивационният медиум се състои от CR1- стоков р-р, естрален кравешки серум, BME essent. amino acids, MEM non essent. amino acids, Gentamycin- стоков р-р. Последната стъпка е прехвърлянето на зиготите в предварително подготвените за култивиране кладенчета от 4-ямкови петрита. Ембрионите се култивират при редуцирано кислородно съдържание (8% О₂ и 5% СО₂) на 39 ^оС и максимална влажност.

По време на специализацията бяха проведени 2 научни експеримента, включващи етапите описани по-горе. В първият експеримент бяха изолирани 280 ооцита за ин витро матуриране. Сформирани бяха 2 групи от по 140 ооцита. След подбор и ин витро фертилизация, за култивиране бяха сформирани 2 групи- едната от 131 зиготи, а другата от 128. Двете групи бяха поставени при различни условия на ин витро култивация- първата при 6% СО₂ и 39 ^оС, а втората при 8% О₂ , 5% СО₂ и 39 ^оС. И при двете групи влажността на въздуха беше 100% . На 7-ят ден беше отчетен броя на бластоцистите във всяка една от групите. Резултатите бяха съответно: 18 бластоциста в първата група и 35 бластоциста във втората група. На 9-ят ден, броят на бластоцистите (в това число и на излюпените бластоцисти) беше 46 в първата и 67 във втората група. Получените резултати недвусмислено подчертават преимуществата на култивацията на говеждите ембриони в условията на ниско съдържание на кислород във въздуха. При вторият експеримент бяха използвани 300 ооцита, като опитната постановка беше същата, описана при първият експеримент. Резултатите отново потвърдиха заключението, направено след отчитането на данните от първия опит.