Участници:Георги Георгиев, докторант

Наименование на посетената институция:

Домакин по визитата е проф. Д-р Удо Маркерт, ръководител на Placenta Lab към университета „Фридрих Шилер”. Лабораторията се намира в Йена, Германия. Изследвателският екип на Клиниката по акушерство и гинекология работи по редица теми, свързани с бременността, включително имунологични механизми на имплантиране на ембриона, регулация на трофобластната инвазия, регулация на децидуални имунни клетки, както и алергологични, фармакологични проблеми и аспекти на храненето. Лабораторията е член на Европейската мрежа EMBIC ("The control of Embryo Implantation").

Период на посещение: 14 юни – 14 юли 2011г.

Цел на посещението:

Темата на едномесечния проект бе „Ин витро ефекти на глюкокортикоиди и мелатонин върху експресионния профил на гранулозни клетки от клетъчна линия COV434”.

Осъществена бе научна програма, включваща:

- Култивиране на COV434 гранулозни клетки;

- Ин витро експеримент;

- Изолиране на тотална РНК от клетките;

- cDNA синтеза (обратна транскрибция);

- End-point singleplex PCR;

- Електрофореза на агарозни гелове.

Седмица 1 (15 – 17 юни):

Първата седмица от посещението включваше запознаване с лабораторията и подготовка на подробен план на експериментално задание и времеви график. Заедно с уточняване на работните протоколи за култивиране и PCR, бяха поръчани необходимите химикали и праймери за експеримента. Бяха извършени пилотни експерименти по култивиране на имортализирана клетъчна линия от гранулозни клетки, предоставена от приемащата лаборатория. Проведен беше PCR с кДНК изолирана от клетките в нормални условия на култивиране и последваща електрофореза в агарозен гел, съгласно установените в лабораторията протоколи. Първата седмица включваше също и запознаване с други методи за работа в лабораторията (FACS, single-cell PCR и др.).

Седмица 2 (20 – 24 юни)

Втората седмица бе определена за провеждане на ин-витро експерименти с култивираните гранулозни клетки. Изолирана бе контролна тотална РНК от замразени клетки според протокола на използвания кит (innuPREP RNA mini kit, Jena Analytik), последвано от синтез на кДНК с кит GoScript™ Reverse Transcription System. Синтезираната кДНК бе използвана за тестване на 9 праймерa, които включваха различни маркери за оценка на функционалния капацитет на култивирана линия.

Седмица 3 (27 – 01 юли)

През третата седмица от посещението бе приключено експерименталното култивиране на клетките. Клетките бяха събрани за PCR анализ, а супернатантите – за измерване концентрация на стероиди. Извършен бе PCR с копи ДНК и геномна ДНК, а след това – електрофореза в агарозен гел и проявяване с UV светлива. По покана на приемащата лаборатория Георги Георгиев участва в методичен семинар на тема “Количествен PCR”.

Седмица 4 & 5 (04 – 08 юли & 11 – 13 юли)

Изолирана беше тотална РНК от всички проби с използване на протокол доставен с комерсиалния кит. Беше извършено количествено определяне на концентрацията на РНК с помощта на Nanodrop™, което потвърди чистотата на изолирания материал. Тоталната РНК след това беше използвана за обратна транскрипция по протокол (GoScript Reverse Transcription System). Всяка от пробите беше използвана за синтеза на к ДНК, както и на отрицателни контроли NTC (no template) и контроли без обратна транскриптаза (RT-). Всяка проба от комплементарна ДНК от контролните и експерименталните клетъчни препарати след това беше анализирана допълнително на PCR с поръчаните за експеримента праймери. Бяха изработени общо 324 проби за PCR, след което същите бяха анализирани в 2% агарозен гел и проявени според протоколите на лабораторията. Резултатите от проведените експерименти бяха представени по време на семинар на 12 юли 2011г.