Участници: главен асистент Деница Даскалова

Наименование на посетената институция:

Партньорски център в Италия - Лаборатория по Биомедицинска ембриология – Център за изследване на стволови клетки, Милански Университет, Италия - проф. Ф.Гандолфи.

Период на посещение: 01.05.2011 - 07.05.2011

Цел на посещението: Обмяна на опит по тема:"Начини за изолиране на РНК и ДНК и PCR анализ".

Осъществена бе научна програма, включваща:

2 Май - разглеждане на лабораторията по Биомедицинска ембриология и други лаборатории в университета. Бях запозната с наличните апарати за PCR анализ. Предостави ми се литература за основните техники за изливане на гелове, за дизайн и избиране на праймери, начини на изолиране на РНК и ДНК, стерилност на работа, съхранение на проби и др. Беше направен пробен PCR на кДНК от овариална тъкан от овце. Пробата е изолирана и съхранявана на -20⁰С. Използваха се FOR_GAPDH и REV _GAPDH праймери. След края на PCR реакцията, беше излят 2% агарозен гел, за визуализация на продукта

3 Май – изолиране на тРНК от овариална тъкан на овце. Процедурата е с продължителност от 2 дни. Бяха размразени овариални тъкани от овце, съхранявани при -80⁰С. След размразяването пробите се нарязват много добре и се прибавя Trizol-reagent. Следват няколко процедури по центрофугиране на пробите, добавяне на хлороформ и изопропанол. След добро миксиране, пробите се оставят за цяла нощ на -20⁰С, за по-добра преципитация.

4 Май - втори етап от процедурата по изолирането на РНК. Пробите се размразяват и се центрофугират за 10 min/ 4000 rpm. Премахва се супернатантата и се добавя ЕtOH, центрофугира се наново и се добавя Н₂О-DEPC. Пробата се слага на 55⁰С/10min. Направената е 2% агарозна електрофореза на изолираната РНК и количеството й измерено спектрофотометрично. Следващата стъпка е получаването на кДНК. Към изолираните проби се добавят Н₂О, Mix1(OligoDT,dNTP), Mix2 (Buf.5x, MgCl2,DTT, RnasiOut) и Super Script II ( в термо блок за 1h/42⁰С – 15 min/ 70⁰С - 4⁰С). Получената ДНК се съхранява на -20⁰С.

5 Май - на получената кДНК е направен PCR анализ. Бяха използвани следните праймери за съответните гени: REV _p53, FOR _p53, FOR _HSP-70, REV _HSP-70.

6 Май - на получензта кДНК е направен PCR анализ. Бияха използвани следните праймери: FOR _S28 и REV _S28